Enfermedades
del tomate
Obtención de reactivos de
diagnóstico para el Tospovirus
Tres especies miembro del género
Tospovirus que producen importantes pérdidas económicas en el cultivo de
tomate en la Argentina son:
-
tomato spotted wilt
virus (TSWV),
-
groundnut ring spot
virus (GRSV) y
-
tomato chlorotic
spot virus (TCSV).
Los Tospovirus
poseen partículas virales esféricas entre 70-110 nm de diámetro que presentan
una envoltura membranosa con proyecciones superficiales. Su genoma, cuya
organización es exclusiva entre los virus vegetales, consiste en 3 ARNs de
cadena simple que asociados con la proteína de la nucleocápside (proteína N)
forman estructuras pseudocirculares.
Para estudios epidemiológicos, de prospección y evaluación de resistencia se
requieren métodos de diagnóstico sensibles y confiables.
Este grupo de trabajo ha ajustado técnicas y desarrollado reactivos de diagnóstico
serológicos y moleculares que permitan alcanzar dichos estándares de
sensibilidad y confiabilidad.
Producción de antisueros
Se han obtenido antisueros contra el TSWV y el GRSV utilizando como antígenos
proteína N purificada de planta enferma y proteína N recombinante expresada en
E.coli. De estos cuatro antisueros, los obtenidos contra proteínas
recombinantes mostraron mayor especificidad (menor o nula reacción contra
planta sana y/o contra otras especies de tospovirus) que los obtenidos contra
proteína viral purificada desde plantas enfermas (Fig. 1). Con estos antisueros
se ajustaron técnicas serológicas como DAS-ELISA y RIPA.
Ajuste de la técnica rápida de inmunodetección en papel de filtro (RIPA).
La RIPA es una excelente herramienta para detectar tospovirus en el campo. Las
propiedades de esta técnica que aventajan a la ELISA son: no requerir de mano
de obra especializada ni de equipo sofisticado, corto tiempo y bajo costo de
realización.
La RIPA consiste en la visualización de la reacción antígeno-anticuerpo como
una banda de color sobre una tira de papel de filtro.
Hay antecedentes sobre el desarrollo de esta técnica para la detección de
otros virus como: CMV (cucumber mosaic virus), TMV (tobacco mosaic virus), bean
yellow mosaic virus (PStV) onion yellow dwarf virus (OYDV) siendo ésta la
primera vez que se ajusta para tospovirus.
Se trabajaron varias alternativas en esta técnica y finalmente se optó por la
“RIPA de dos pasos”. En este método el papel posee una banda de látex blanco sensibilizada con anticuerpos específicos. Se incuba en una dilución de
la muestra problema durante 10 minutos. Por último se vuelve a incubar durante
20 minutos en una solución de látex de color (rojo, azul, etc.) sensibilizada
con anticuerpos específicos. El látex de color al difundir por el papel
reacciona con el antígeno inmovilizado en la banda de látex blanco tornándola
de color visible.
Esta técnica se ajustó en nuestro laboratorio para la detección del GRSV y
del TSWV. En ambos casos se utilizaron antisueros producidos en el IFIVE a
partir de proteínas recombinantes expresadas en E. coli.
Tomate “peste negra”: Generación de
plantas transgénicas resistentes a Tospovirus.
La resistencia a tospovirus en plantas transgénicas portadoras del gen N es
mediada por RNA e involucraría mecanismos de silenciamiento génico
postranscripcional. Este tipo de resistencia es por lo general muy efectiva, próxima
a la inmunidad, pero altamente específica, es decir de muy estrecho rango.
Nuestro grupo está desarrollando construcciones génicas tendientes a lograr un
más amplio rango de cobertura de resistencia a tospovirus si disminuir su
efectividad. Dichas construcciones serán probadas inicialmente en tabaco y
luego en tomate (Lycopersicon esculentum) y lechuga (Lactuca sativa).
Por esta razón, tanto en tomate como en lechuga se encuentran avanzados los
trabajos de regeneración de plantas completas y se están iniciando los
trabajos de transformación de variedades argentinas con valor comercial en
ambas especies hortícolas con genes reporteros.
Producción de antisueros anti PDV y PRSV utilizando proteínas recombinantes
como antígenos
El miembro típico del grupo, el tobacco streak virus es el mejor caracterizado
aunque los Ilarvirus comprenden al menos 16 virus más, muchos de los cuales son
patógenos de especies leñosas. Son virus fitopatógenos que poseen partículas
esferoidales de 28 mm de diámetro y que se caracterizan por poseer genoma
tripartito de RNA simple cadena de sentido positivo con un cuarto RNA subgenómico
que es también encapsidado independientemente.
En la Argentina. se reconoció la presencia del prunus necrotic ring spot virus (PNRSV)
y del prune dwarf ilarvirus (PDV) en las colecciones de prunoideas mantenidas
por EEA-INTA, Facs. de Agronomía (Univ. Nac. de Córdoba) y en montes de
producción, durante 1989-1994.
Dado lo complejo de la purificación de partículas de Ilarvirus a partir de
plantas infectadas se decidió clonar el gen de la cápside proteica de los dos
llarvirus presentes en Argentina (PDV y PNRSV) y expresarlos en un sistema
procariote para ser usados como inmunógeno .
En la actualidad se está trabajando en el ajuste de un DAS-ELISA para PDV y
para PNRSV.
Caracterización molecular de aislamientos
chilenos del plum pox virus, agente causal de la enfermedad de sharkas.
El plum pox virus es el agente causal del sharkas (viruela) de los frutales de
carozo (durazneros, ciruelos, damascos y cerezos), virosis que se caracteriza
por ocasionar serias pérdidas en la producción de los Prunus. Los primeros síntomas
de la enfermedad aparecen en hojas como manchas, anillos o bandas cloróticas.
En los frutos inmaduros, se evidencian anillos o manchas y por debajo de éstas
la pulpa se torna castaño-rojiza y se satura de gomas que llegan hasta el
carozo.
Argentina requiere definir si el PPV ha sido introducido al país y establecer
la identidad del PPV encontrado en Chile mediante su caracterización molecular
a fin de establecer diferencias o similitudes con los ya secuenciados en Europa.
Estos conocimientos permitirán orientar medidas destinadas al manejo del PPV
presente en Argentina o de su prevención.
En este plan se pretende alcanzar la caracterización molecular mediante el
clonado y secuenciación del extremo 3’del RNA genómico de los aislamientos
del PPV presentes en los montes de prunoideas de Chile que a su vez pueden estar
presentes en los montes de Argentina y establecer diferencias o semejanzas con
razas ya secuenciadas en Europa. Al mismo tiempo se intentará la producción de
reactivos de diagnóstico empleando proteínas recombinantes como antígenos,
para ser empleados en la detección del PPV.
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