PRODUCCIÓN  HORTÍCOLA
 

Enfermedades del tomate

Obtención de reactivos de diagnóstico para el Tospovirus

Tres especies miembro del género Tospovirus que producen importantes pérdidas económicas en el cultivo de tomate en la Argentina son:

  • tomato spotted wilt virus (TSWV), 

  • groundnut ring spot virus (GRSV) y

  • tomato chlorotic spot virus (TCSV).

Los Tospovirus poseen partículas virales esféricas entre 70-110 nm de diámetro que presentan una envoltura membranosa con proyecciones superficiales. Su genoma, cuya organización es exclusiva entre los virus vegetales, consiste en 3 ARNs de cadena simple que asociados con la proteína de la nucleocápside (proteína N) forman estructuras pseudocirculares.

Para estudios epidemiológicos, de prospección y evaluación de resistencia se requieren métodos de diagnóstico sensibles y confiables.
Este grupo de trabajo ha ajustado técnicas y desarrollado reactivos de diagnóstico serológicos y moleculares que permitan alcanzar dichos estándares de sensibilidad y confiabilidad.


Producción de antisueros


Se han obtenido antisueros contra el TSWV y el GRSV utilizando como antígenos proteína N purificada de planta enferma y proteína N recombinante expresada en E.coli. De estos cuatro antisueros, los obtenidos contra proteínas recombinantes mostraron mayor especificidad (menor o nula reacción contra planta sana y/o contra otras especies de tospovirus) que los obtenidos contra proteína viral purificada desde plantas enfermas (Fig. 1). Con estos antisueros se ajustaron técnicas serológicas como DAS-ELISA y RIPA.

Ajuste de la técnica rápida de inmunodetección en papel de filtro (RIPA).
La RIPA es una excelente herramienta para detectar tospovirus en el campo. Las propiedades de esta técnica que aventajan a la ELISA son: no requerir de mano de obra especializada ni de equipo sofisticado, corto tiempo y bajo costo de realización.
La RIPA consiste en la visualización de la reacción antígeno-anticuerpo como una banda de color sobre una tira de papel de filtro.

Hay antecedentes sobre el desarrollo de esta técnica para la detección de otros virus como: CMV (cucumber mosaic virus), TMV (tobacco mosaic virus), bean yellow mosaic virus (PStV) onion yellow dwarf virus (OYDV) siendo ésta la primera vez que se ajusta para tospovirus.

Se trabajaron varias alternativas en esta técnica y finalmente se optó por la “RIPA de dos pasos”. En este método el papel posee una banda de látex blanco sensibilizada con anticuerpos específicos. Se incuba en una dilución de la muestra problema durante 10 minutos. Por último se vuelve a incubar durante 20 minutos en una solución de látex de color (rojo, azul, etc.) sensibilizada con anticuerpos específicos. El látex de color al difundir por el papel reacciona con el antígeno inmovilizado en la banda de látex blanco tornándola de color visible.

Esta técnica se ajustó en nuestro laboratorio para la detección del GRSV y del TSWV. En ambos casos se utilizaron antisueros producidos en el IFIVE a partir de proteínas recombinantes expresadas en E. coli.


Tomate “peste negra”: Generación de plantas transgénicas resistentes a Tospovirus.
La resistencia a tospovirus en plantas transgénicas portadoras del gen N es mediada por RNA e involucraría mecanismos de silenciamiento génico postranscripcional. Este tipo de resistencia es por lo general muy efectiva, próxima a la inmunidad, pero altamente específica, es decir de muy estrecho rango.

Nuestro grupo está desarrollando construcciones génicas tendientes a lograr un más amplio rango de cobertura de resistencia a tospovirus si disminuir su efectividad. Dichas construcciones serán probadas inicialmente en tabaco y luego en tomate (Lycopersicon esculentum) y lechuga (Lactuca sativa).

Por esta razón, tanto en tomate como en lechuga se encuentran avanzados los trabajos de regeneración de plantas completas y se están iniciando los trabajos de transformación de variedades argentinas con valor comercial en ambas especies hortícolas con genes reporteros.

Producción de antisueros anti PDV y PRSV utilizando proteínas recombinantes como antígenos

El miembro típico del grupo, el tobacco streak virus es el mejor caracterizado aunque los Ilarvirus comprenden al menos 16 virus más, muchos de los cuales son patógenos de especies leñosas. Son virus fitopatógenos que poseen partículas esferoidales de 28 mm de diámetro y que se caracterizan por poseer genoma tripartito de RNA simple cadena de sentido positivo con un cuarto RNA subgenómico que es también encapsidado independientemente.

En la Argentina. se reconoció la presencia del prunus necrotic ring spot virus (PNRSV) y del prune dwarf ilarvirus (PDV) en las colecciones de prunoideas mantenidas por EEA-INTA, Facs. de Agronomía (Univ. Nac. de Córdoba) y en montes de producción, durante 1989-1994.
Dado lo complejo de la purificación de partículas de Ilarvirus a partir de plantas infectadas se decidió clonar el gen de la cápside proteica de los dos llarvirus presentes en Argentina (PDV y PNRSV) y expresarlos en un sistema procariote para ser usados como inmunógeno .
En la actualidad se está trabajando en el ajuste de un DAS-ELISA para PDV y para PNRSV.

Caracterización molecular de aislamientos chilenos del plum pox virus, agente causal de la enfermedad de sharkas.
El plum pox virus es el agente causal del sharkas (viruela) de los frutales de carozo (durazneros, ciruelos, damascos y cerezos), virosis que se caracteriza por ocasionar serias pérdidas en la producción de los Prunus. Los primeros síntomas de la enfermedad aparecen en hojas como manchas, anillos o bandas cloróticas. En los frutos inmaduros, se evidencian anillos o manchas y por debajo de éstas la pulpa se torna castaño-rojiza y se satura de gomas que llegan hasta el carozo.

Argentina requiere definir si el PPV ha sido introducido al país y establecer la identidad del PPV encontrado en Chile mediante su caracterización molecular a fin de establecer diferencias o similitudes con los ya secuenciados en Europa. Estos conocimientos permitirán orientar medidas destinadas al manejo del PPV presente en Argentina o de su prevención.
En este plan se pretende alcanzar la caracterización molecular mediante el clonado y secuenciación del extremo 3’del RNA genómico de los aislamientos del PPV presentes en los montes de prunoideas de Chile que a su vez pueden estar presentes en los montes de Argentina y establecer diferencias o semejanzas con razas ya secuenciadas en Europa. Al mismo tiempo se intentará la producción de reactivos de diagnóstico empleando proteínas recombinantes como antígenos, para ser empleados en la detección del PPV.
 

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